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        蛋白純化中層析介質的品質影響因素

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        點擊次數:2808 更新時間:2019年11月29日11:55:08 打印此頁 關閉

        一:基質材料

            層析介質常用的基質材料有無機化合物組成硅膠,也有有機化合物組成的聚苯乙烯,還有純化生物大分子最常用的多糖聚合物(瓊脂糖,葡聚糖,纖維素)等。


           1.硅膠系列的介質,其剛性大,但不耐堿,多用于制備正反向層析介質,在小分子化合物提取分離,特別是植物提取行業廣泛應用,也多用于分析型色譜柱介質的制備。

           2.聚苯乙烯系列填料,剛性較強,層析過程傳質速度高,但是其親水性差疏水性強,生物相容性差,多用于多肽,生物堿等物質的分離提純,也有少部分用于生物大分子純化。

           3.多糖系列層析介質,目前有瓊脂糖微球,葡聚糖微球,瓊脂糖交聯葡聚糖微球,瓊脂糖交聯纖維素微球等為基質制備而成的各種層析介質,廣泛用于疫苗,抗體,蛋白,血液制品,生長因子,酶的分離純化,其生物相容性良好。如Focudex G-25廣泛用于生物大分子的脫鹽,是葡聚糖交流纖維素制備而成的凝膠過濾介質,而Focurose 4FF廣告用于疫苗的分離純化,是交聯瓊脂糖制備而成的凝膠過濾介質等。

          

           交聯瓊脂糖制備而成的介質應用最為廣泛,如GE公司的Sepharose FF系列介質,在離子交換介質,親和介質,疏水介質制備上應用最為廣泛。

           葡聚糖交聯纖維微球介質,如GE公司Sephadex系列介質,在生物大分子脫鹽及小分子多肽分離純化中廣泛應用。

           葡聚糖交聯瓊脂糖微球介質,如GE公司的Sepharose XL介質,其即可避免介質和蛋白結合的空間位阻,又提高了可利用配基的密度,從而大幅度提高了介質的載量,比FF基質的填料有明顯的載量優勢,也廣泛用于生物大分子的分離純化。

          瓊脂糖交聯纖維微球介質,如GE公司的Capto,此類介質比瓊脂糖微球的介質有更高的耐壓性,在使用時有更高的傳質速率,有更優秀的品質,在收率,載量,分辨率方面都有明顯優勢,此類基質的多糖介質是多糖介質發展的趨勢,但因其生產工藝復雜,成本高目前還未完全取代瓊脂糖微球介質。

          二:介質流速    

            介質的流速指在給定的條件下,如給定壓力,給定柱床高度,給定緩沖液類型測的數值,不同方法測定的流速不一樣。

             1.同一材質的介質,粒徑越小流速越小。

             2.同一材質的介質,裝填高度越高流速越小。     

             在使用過程中即要保證料液和介質足夠的接觸時間,又要保證合適的流速,這需要摸索實驗確定最佳控制流速。

         三:孔徑

                 層析介質孔徑分布,不同的測定方法測定出來差異較大。不同物質分離純化在孔徑選擇上略有差異。不同孔徑分布的純化介質吸附解吸附的熱動力學過程有差異。不同孔徑分布的純化介質耐壓性,載量,結合結合強度方面有差異。

              生物大分子純化層析介質,以多糖基質的居多,交聯瓊脂糖制備而成的介質應用最為廣泛,如GE公司的Sepharose 4FF和6FF系列,在離子交換介質,親和介質,疏水介質制備上應用最為廣泛。其中4FF的平均孔徑是40nm,而6FF的平均孔徑是27nm。100KD以內的物質優選6FF基質的介質,100KD到1000KD的物質優選4FF基質的介質。

             葡聚糖交聯瓊脂糖微球介質,如GE公司的Sepharose XL,其即可避免介質和蛋白結合的空間位阻,又提高了可利用配基的密度,從而大幅度提高了介質的載量,比FF基質的填料有明顯的載量優勢,也廣泛用于生物大分子的分離純化。如DEAE Focurose 6XL在肝素鈉及胰蛋白酶的分離純化中表現出良好的品質,廣泛用于天然蛋白的分離純化。XL系列的填料孔徑平均在36nm左右。純化小于100KD的物質優選。

            瓊脂糖交聯纖維微球介質,如GE公司的Capto此類介質比瓊脂糖微球的介質有更高的耐壓性,在使用時有更高的傳質速率,有更優秀的品質,在收率,載量,分辨率方面都有明顯優勢,此類基質的多糖介質是多糖介質發展的趨勢,但因其生產工藝復雜,成本高目前還未完全取代瓊脂糖微球介質。此類填料的平均孔徑在35nm左右。

         四:粒徑    

             1.同一材質的介質,粒徑越小裝柱后有更高的理論塔板數,所以粒徑越小分辨率越高。

             2.同一材質的介質,粒徑越小同樣體積的介質比表面積越大,所以載量越高。

             3.同一材質的介質,粒徑越小裝柱后反壓越大,流速越小。

             4.同一材質的介質,粒徑越小理論塔板數越高,其回收率也隨粒徑的變小而增大。這可能與分辨率越高,在收集時開始收集狀態更好把控有關。

             5.同一材質的介質,粒徑分布的越均一或分布區間越小,裝填后理論塔板數就越高,分辨率就越高。粒徑一致的介質稱為單分散介質,其分辨率最高,當然粒徑分布對填料的影響同時遵循粒徑大小對介質性能的影響,如單分散為60um的介質比單分散粒徑為25um的介質的分辨率要低。

            6.同一粒徑分布范圍的介質,分布區間的正太分布區間越小,越集中,其分辨率越高。

            7.同一粒徑分布范圍介質,平均粒徑也會影響其品質和性能,平均粒徑偏小分辨率高,但是流速小,偏大流速大,但是分辨率低。如都是45-165um范圍的介質,平均粒徑為75um的就比平均粒徑為100um的裝填后反壓要大,分辨率要高。

            8.同一材質,同一粒徑分布范圍的填料(如瓊脂糖FF系列介質),不同廠家在粒徑的均一性上相差較大,最終也會導致在載量,流速,分辨率等方面差異較大。同一材質的介質,粒徑越小往往價格越高。

              粒徑分布的特征:

             粒徑分布包括兩個方面平均粒徑和粒徑范圍。

             1.硅膠系列介質的粒徑,目前市場上有單分散微球(粒徑均一的,從10um---100um的都有),也有不定型的(介質顆粒是不規則的形狀的,粒徑分布寬泛),單分散的比不定型的品質要好很多,當然價格也貴很多。

            2.聚合物系列介質的粒徑,目前市場上單分散微球居多,粒徑從10um到200um的都有。

            3.多糖系列介質,粒徑分布都是一定的范圍,GE公司的Sepharose 4FF和6FF系列,都是90um,粒徑范圍在45-165um. 如GE公司的Sepharose HP系列介質平均粒徑都是37um,粒徑分布都25--45um。如GE公司的Sepharose Big Beads系列介質平均粒徑都是200um,粒徑范圍都是165um到300um.

        五:介質選擇和分辨率

           了解介質的選擇性先從介質的結構開始,除凝膠過濾介質是要靠填料的孔和微球之間的間隙去分配不同物質的,離子,親和,疏水三種吸附層析介質都有一定的選擇性,其選擇性是由介質結構中的配基決定的。一個介質的配基確定后,其可識別的分子或基團就確定了,介質的選擇性顧名思義也就是其識別能力。

             介質的選擇性是介質的一個特征,選擇性由其配基決定,親和的選擇性最高,大多親和介質都趨于一對一的精準識別,疏水介質的分辨率也很高,離子交換介質識別帶一類電荷的物質,相比親和選擇性就要差一些。

        介質的分辨率是介質分離物質的能力描述,這與多方面因素有關。

            1.介質的粒徑越小,裝柱后理論塔板數越高,分辨率也越高。如GE公司的Sepharose FF系列介質的分辨率就要比GE公司的Sepharose HP系列介質的分辨率小,也因此HP系列的介質稱為高分辨率介質。

            2.在一定范圍內,介質的結合載量的提高會導致其分辨率下降。

            3.介質裝填時,隨裝填高度的增加分辨率也增加,但是反壓也增大。

            4.層析緩沖液也會影響介質的分辨率,比如離子交換介質使用時,用2M NaCl直接洗脫,此時就失去了分辨帶不同電荷物質的能力。

            5.層析過程的控制也會影響介質的分辨率,比如流速,通常流速增大分辨率降低。

            6.介質的保養及清洗也會影響介質的分辨率,使用后要及時對介質進行CIP,避免沉積在介質中的雜質影響分離過程,導致介質的分辨率下降。

             不同類型的介質選擇性和適用性有差異,選擇性通常是和適用性融合起來的,一種介質能識別某種物質,那么這個物質就適用此介質來純化。

        六:配基密度和載量

            配基密度與介質的基質材料有關,不同的基質其表面用來交聯配基的基團不一樣且活過過程及活化方式影響很大。如GE公司的Sepharose FF系列就比Sepharose 4B/6B可用來交聯的基團就要少。  

             瓊脂糖微球介質:4B(4%瓊脂糖)--CL-4B(低強度交聯)--4FF(高強度交聯),剛性逐漸增強,耐壓性提升,但是在交聯的過程中部分基團已經被占據,所以可交聯上去的配基逐漸減少,制備的介質配基密度逐漸減小。交聯配基的條件及過程控制應做相應調整,與此同時每交聯一次,或多或少都會產生一些非特異性吸附的基團,對介質的品質產生一定的影響,從4B到4FF,非特異性吸附逐漸增大。

           2.配基密度與介質的粒徑還有關,粒徑越小比表面積越大,可用來交聯配基的基團也就越多,所以同一材質小粒徑制備而成的介質比大粒徑制備成的介質配基密度要高

           載量

            1.理論上介質的配基密度越高其載量越高,但是實際上載量不僅與介質的配基密度有關,而且與配基的交聯方式有關,而交聯方式影響更大?;罨绞?,活化的過程控制絕對介質結構中的間隔臂,間隔壁通常不影響介質的配基密度,單對介質的載量影響較大。如GE公司的Sepharose FF系列介質就比GE的Sepharose XL系系列的載量要低很多,配基密度差異并不大。

           2.動態載量是在一定條件下即模式使用過程(孵育時間/上樣流速,柱床高度,緩沖液,固定的樣品)測得一個數值。也意味著同一介質用于不同的樣品其動態載量有差異。

           3.靜態載量即飽和載量,也在固定條件下讓介質充分和樣品接觸,以達到飽和吸附,以此測的數據為靜態載量,對使用指導意義不大,市售介質參數描述的載量都指的動態載量。

            4.介質的動態載量與測定蛋白的種類,結構性質,分子量都有很大關系,也與測定時的流速等有關,而且測定時通常用的單一的蛋白測定,然而在我們使用介質純化蛋白時,通常和介質結合的不僅有目標蛋白還有雜蛋白,所以我們推薦在使用介質時先對樣品的蛋白濃度做出預估,并且上樣量控制在介質載量的50%以內,避免蛋白流穿降低回收率。在使用時可通過優化層析條件或延長介質和料液的接觸時間(降低流速)來保證介質的載量。   

            5.介質的載量也影響其識別及結合能力。

            6.介質的載量也與其粒徑大小及孔徑大小有關,載量的表征是很多因素綜合的一個結果。   

            7.介質的載量影響其分辨率,載量提升,其結合能力增強,但是特異性識別能力減小。載量升高分辨率下降。

            8.載量受很多因素影響,也會影響介質的性能,所以我們在選擇介質的時候切勿盲目一味追求高載量,不同純化階段,需考慮不同的因素,所以我們在選擇介質的時候要根據我們項目的屬性,綜合評估去選擇合適的介質。

        七:清洗、保存   

             層析介質的維護是層析介質壽命的關鍵影響因素。層析介質在使用過程,物料和其接觸后,洗脫之后,殘留的蛋白,核酸,內毒素,色素及緩沖液中的雜質也污染了介質,這些污染物不僅影響介質的性能,也會污染目標產品,通過再生,清洗及消毒的方式去除這些污染的過程通稱為介質的維護。

            1.再生

            恢復介質的原有功能,每使用一個循環后進行。

        *離子交換介質用2M氯化鈉流經柱床2個CV即可達到再生的目的。

        *Ni Focurose 6FF IMAC介質的再生通常需要用1M的咪唑加1M的氯化鈉進行再生,同樣也流經柱床2CV.

        *疏水層析介質通常用純水或低濃度的緩沖液進行再生。

        *凝膠過濾介質通常用2M氯化鈉再生。

        2.清洗(CIP):

            去除再生沒有去除的雜質及介質中積累的污染物,所以清洗過程比再生過程往往要劇烈,清洗要根據層析介質的類型耐受性,物料的性質,層析介質所處的工藝階段,層析柱及層析系統的耐受性等綜合考慮清洗的狀態,通常使用1-10個循環清洗一次,同時要選擇合適的清洗試劑。

             通過試驗證明清洗有效且污染物的殘留及清洗試劑殘留已經降低到安全水平的工作就是清洗驗證。清洗驗證可通過檢測載量,流速及清洗試劑殘留的方式去驗證。因此不同的工藝過程,介質的清洗有不同的操作模式和方法,清洗驗證是整個目標物制備工藝中的一部分。

        3.消毒:

            層析介質的消毒主要作用是去除層析介質中的微生物以及內毒素等有害物質。每一批物料處理完后都要對介質進行消毒。常用的消毒方式是使用0.5-1M的氫氧化鈉和介質接觸30-60min。特別注意,部分介質不耐受氫氧化鈉或者只耐受低濃度的氫氧化鈉,如Protein G Focurose 4FF介質不耐受氫氧化鈉,此時就要選擇其它方式,比如用70%的乙醇進行消毒等。另外消毒過程往往會和清洗過程重合,消毒也可作為清洗的一部分。

        4.保存:

        a.未使用的層析介質通常都是保存在20%的乙醇中,常溫保存(4-35度),親和介質有一部分需要在4度保存。

        b.裝填在層析柱的介質保存,需要保存在濕度小潔凈的環境中(建議萬級),常用10mM的氫氧化納作為保存劑,親和介質用20%乙醇作為保存劑。








          




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