<u id="2n9ji"></u>
      <video id="2n9ji"><input id="2n9ji"></input></video>
      
      <bdo id="2n9ji"></bdo>
      1. 在線客服
        熱線電話
        • 13458592595
              

        DNA,siRNA成功轉染的關鍵點

        分享到:
        點擊次數:6272 更新時間:2020年01月19日12:54:39 打印此頁 關閉

        一、質粒DNA細胞轉染實驗,應注意以下幾點

        1、質粒的大小和質量

           線性化還是超螺旋會影響轉染結果:超螺旋質粒的轉染效率比線性DNA高得多,特別是瞬時轉染。而線性化DNA轉染的整合幾率高。質粒太大了轉染會困難一些。畢竟,相對致密、較小的外源異物被細胞內吞的幾率要大一些。如果你的質粒正好比較大,又沒有經驗,選擇特別注明可以轉大質粒的轉染試劑成功幾率會高一些。有的轉染試劑還會提供一些促進DNA凝聚的成分,使得DNA形成轉染復合物時更致密一些,更容易轉染一些。純化質粒的質量也會影響轉染效率,一定要選擇高質量的質粒。

        2、質粒DNA的濃度和量       

            做轉染實驗,質粒的純度是一定要的。OD值260/280在1.8左右,是一個基本的指標,即沒有蛋白和RNA 污染。最重要的是內毒素要清除干凈。內毒素清除的效果,才是是否用于轉染的決定指標。既然質粒純化已經不成問題,初學者通常都不會在乎甚至愿意多加點DNA,但是要注意的是,DNA量過少固然轉染效率不高,DNA量過多同樣會降低轉染效率。所以預實驗需要按照說明書的要求,按一定比例混合適量的質粒DNA和轉染試劑。有的轉染試劑要求DNA的量多些,有的轉染試劑效率高只要很少DNA。

        3、轉染試劑的選擇

           在確定了質粒的質量之后,就要考慮轉染試劑的選擇了。目前大多數用的是脂質體類的轉染試劑,但這類試劑的毒性較大,轉染效率低,最好選擇非脂質體的轉染試劑,如Entranster試劑。

        二、成功siRNA轉染的主要關鍵點有什么?

              1.設計合成有效的siRNA

            RNAi的核心需要siRNA對相應mRNA進行有效的結合和作用。siRNA的設計合成首先很重要,最優的設計可以用最小的工作濃度取得滿意的沉 默效果,減少副反應的發生。siRNA的設計可以通過檢索,優先選用經過驗證的siRNA或設計多對siRNA。需要強調的是,需要同時設置陰性對照以排 除非特異沉默現象和陽性對照以確認整個實驗體系的有效性。

             2.合成的siRNA注意純度和工作濃度

              siRNA的合成需要注意的是一定要選用高純度的siRNA,siRNA的純度直接關系到轉染效率和沉默效率。siRNA的工作濃度和siRNA的設計、細胞種類、目標基因有關。建議一定進行相關的預實驗優化各條件。

           3.選擇合適的siRNA轉染試劑

             選擇合適的siRNA轉染試劑是的RNAi實驗成功另一個關鍵。由于細胞毒性對siRNA實 驗的影響非常大,可以直接影響實驗結論和結果,所以一定選擇低毒性的轉染試劑,看一個轉染試劑毒性是否低,有一個簡單的方法,看轉染的過程和要求,比如要 求的細胞密度越大,說明毒性越大,比如轉染復合物容許和細胞孵育的時間越短,說明毒性越大。除了低毒性,還最好操作簡便,越簡單越好,比如有的轉染試劑要 求轉染前換無血清培養基或低血清培養基,轉染后又要有血清培養基,實際上,由于培養條件的頻繁變化,可能會對細胞表達模式產生影響,對后續的mRNA和蛋 白分析也同樣產生影響,最終影響實驗的可靠性。

           4、健康的細胞培養物和嚴格的操作確保轉染的重復性

          通常,健康的細胞轉染效率較高。此外,較低的傳代數能確保每次實驗所用細胞的穩定性。為了優化實驗,推薦用50代以下的轉染細胞,否則細胞轉染效率會隨時間明顯下降。

        siRNA轉染后細胞死亡

        原因也是多樣的,如脂質體毒性,轉染濃度過高,轉染前的細胞狀態不佳等都可能導致轉染后細胞死亡的情況發生,這種情況下就需要適當優化轉染條件;可以選擇細胞毒性小的非脂質體類的轉染試劑,如Entranster試劑,另外,如果siRNA所靶向的基因對于維持細胞生長是非常重要的,出現細胞死亡的現象可能正是由于基因干擾引起的,如果由于細胞死亡而影響檢測的話,可以適當調整檢測時間。實驗條件的優化,包括轉染前細胞密度調整,轉染濃度,檢測時間等。

               siRNA沉默效率的檢測

           1.PCR檢測mRNA水平的沉默效果,一般推薦在48h到72h檢測吧??赡?8h比較理想吧。需要具體的摸所時間。

           2.WB檢測蛋白蛋白水平的檢測,一般在轉染后48h到92h間提蛋白檢測蛋白水平的沉默效果,檢測時間跟你的蛋白的半衰期有關系,具體的時間需要設計時間梯度,一般理想的是在72h最明顯。

           3.PCR檢測沉迷效果時,在設計引物的時候最好是將引物設計在沉默位點的兩側,而不是在同側。這個是由于RNAi引起的沉默是先進行mRNA的切割之后造成mRNA的降解。這個可能切割和降解具有不同的時間點。即使不能設計在同側,也不要離沉默位點太遠的地方。不然可能會造成對沉默效果的低估。

           4.關于siRNA的陽性對照。如果你的實驗中出現了siRNA的轉染效率很高能夠達到70以上,而siRNA的沉默效率始終很低的話,這個時候你需要懷疑你的siRNA的效果問題了。這個時候可以做下siRNA的陽性對照。陽性對照有actin和gapdh等?;居嗅槍@些基因的特異性的高效的siRNA序列。




        上一條:siRNA轉染與DNA轉染對應轉染試劑的區別? 下一條:Cellvis激光共聚焦耗材選擇
        女人一级毛片内射_色天天综合久久久久综合片_国产小视频在线观看_久久91热狠狠色精品一区
            <u id="2n9ji"></u>
            <video id="2n9ji"><input id="2n9ji"></input></video>
            
            <bdo id="2n9ji"></bdo>