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        你想知道的蛋白提取純化知識全在這了

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        點擊次數:2693 更新時間:2020年02月20日12:04:10 打印此頁 關閉

            蛋白質是包括人類在內的各種生物有機體的重要組成成分,是生命的物質基礎之一。生物體的生長、發育、遺傳和繁殖等一切生命活動都離不開蛋白質。


        隨著分子生物學、結構生物學、基因組學等研究的不斷深入,人們意識到僅僅依靠基因組的序列分析來試圖闡明生命活動的現象和本質是遠遠不夠的。只有從蛋白質組學的角度對所有蛋白質的總和進行研究,才能更科學地掌握生命現象和活動規律,更完善地揭示生命的本質。


        由此許多學者將生命科學領域的研究焦點從基因轉向蛋白質,使蛋白質成為揭示生命活動現象和分子生物學機理的重要研究對象。研究蛋白質首要的步驟是將目的蛋白從復雜的大分子混合物中分離純化出來,得到高純度具有生物學活性的目的物。因此,高效的純化技術和手段是蛋白質研究的重要基礎和關鍵之一。

        蛋白提取純化程序


        分離純化某一特定蛋白質的一般程序可以分為前處理、粗分離、精細分離三個步驟。


        01

        前處理


        分離純化某種蛋白質,首先要把蛋白質從原來的組織或細胞中以溶解的狀態釋放出來并保持原來的天然狀態,不丟失生物活性。


        為此,動物材料應先剔除結締組織和脂肪組織,種子材料應先去殼甚至去種皮以免受單寧等物質的污染,油料種子最好先用低沸點的有機溶劑如乙醚等脫脂。然后根據不同的情況,選擇適當的方法,將組織和細胞破碎。


        動物組織和細胞可用電動搗碎機或勻漿機破碎或用超聲波處理破碎。植物組織和細胞一般需要用石英砂或玻璃粉和適當的提取液一起研磨的方法或用纖維素酶處理也能達到目的。細菌細胞的破碎比較麻煩,破碎細菌細胞壁的常用方法有超聲波破碎,與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理等。


        組織和細胞破碎后,選擇適當的緩沖液把所要的蛋白提取出來。細胞碎片等不溶物用離心或過濾的方法除去。


        如果所要的蛋白主要集中在某一細胞組分,如細胞核、染色體、核糖體或可溶性細胞質等,則可利用差速離心的方法將它們分開,收集該細胞組分作為下步純化的材料。如果碰上所要蛋白是與細胞膜或膜質細胞器結合的,則必須利用超聲波或去污劑使膜結構解聚,然后用適當介質提取。


        02

        粗分離


        當蛋白質提取液(有時還雜有核酸、多糖之類)獲得后,選用一套適當的方法,將所要的蛋白與其他雜蛋白分離開來。一般這一步的分離用超濾、鹽析、等電點沉淀和有機溶劑分級分離等方法。這些方法的特點是簡便、處理量大,既能除去大量雜質,又能濃縮蛋白溶液。


        03

        精細分離


        樣品經粗分級分離以后,一般體積較小,雜蛋白大部分已被除去。進一步純化,一般使用層析法包括離子交換層析、親和層析、疏水層析以及分子篩等。必要時還可選擇電泳法,包括區帶電泳、等電點聚焦等作為最后的純化步驟。用于細分級分離的方法一般規模較小,但分辨率很高。


        結晶是蛋白質分離純化的最后步驟。盡管結晶過程并不能保證蛋白一定是均一的,但是只有某種蛋白在溶液中數量上占有優勢時才能形成結晶。結晶過程本身也伴隨著一定程度的純化,而重結晶又可除去少量夾雜的蛋白。由于結晶過程中從未發現過變性蛋白,因此蛋白的結晶不僅是純度的一個標志,也是斷定制品處于天然狀態的有力指標。

        蛋白提取純化方法



        01

        蛋白質(包括酶)的提取


        大部分蛋白質都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液,少數與脂類結合的蛋白質則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中,因些,可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質及酶。


        (1)水溶液提取法

        稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑,通常用量是原材料體積的1-5倍,提取時需要均勻的攪拌,以利于蛋白質的溶解。提取的溫度要視有效成份性質而定。


        一方面,多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大,因此,溫度高利于溶解,縮短提取時間。

        但另一方面,溫度升高會使蛋白質變性失活,因此,基于這一點考慮提取蛋白質和酶時一般采用低溫(5度以下)操作。為了避免蛋白質提取過程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制劑(如二異丙基氟磷酸,碘乙酸等)。


        下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇:





        a.pH值

        蛋白質,酶是具有等電點的兩性電解質,提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩側的pH 范圍內。用稀酸或稀堿提取時,應防止過酸或過堿而引起蛋白質可解離基團發生變化,從而導致蛋白質構象的不可逆變化,一般來說,堿性蛋白質用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白質用偏堿性的提取液。


        b.鹽濃度

        稀濃度可促進蛋白質的溶,稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質部分結合,具有保護蛋白質不易變性的優點,因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽,一般以0.15摩爾。升濃度為宜。緩沖液常采用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。



        (2)有機溶劑提取法

        一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶,不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑,它們具的一定的親水性,還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。


        丁醇提取法對提取一些與脂質結合緊密的蛋白質和酶特別優越,一是因為丁醇親脂性強,特別是溶解磷脂的能力強;二是丁醇兼具親水性,在溶解度范圍內(度為10%,40度為6.6%)不會引起酶的變性失活。另外,丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣,也適用于動植物及微生物材料。

        02

        蛋白質的分離純化



        根據蛋白質溶解度不同的分離方法

        (1)蛋白質的鹽析

        中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響,一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高,蛋白質的溶解度增加,此稱鹽溶;當鹽濃度繼續升高時,蛋白質的溶解度不同程度下降并先后析出,這種現象稱鹽析,將大量鹽加到蛋白質溶液中,高濃度的鹽離子(如硫酸銨的SO4和NH4)有很強的水化力,可奪取蛋白質分子的水化層,使之“失水”,于是蛋白質膠粒凝結并沉淀析出。


        鹽析時若溶液pH在蛋白質等電點則效果更好。由于各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同,故鹽析所需的鹽濃度也不一樣,因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉淀。


        影響鹽析的因素有:

        (a)溫度:除對溫度敏感的蛋白質在低溫(4度)操作外,一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶介度降低。但有的蛋白質(如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白)在較高的溫度(25度)比0度時溶解度低,更容易鹽析。

        (b)pH值:大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶解度最低。

        (c)蛋白質濃度:蛋白質濃度高時,欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉淀出來(共沉現象)。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋,使蛋白質含量在2.5-3.0%。


        蛋白質鹽析常用的中性鹽,主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應用最多的硫酸銨;另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好,不易引起蛋白質變性。


        蛋白質在用鹽析沉淀分離后,需要將蛋白質中的鹽除去,常用的辦法是透析,即把蛋白質溶液裝入秀析袋內(常用的是玻璃紙),用緩沖液進行透析,并不斷的更換緩沖液,因透析所需時間較長,所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽,所用的時間就比較短。


        (2)等電點沉淀法

        蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小,因而溶解度也最小,各種蛋白質的等電點有差別,可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉淀,但此法很少單獨使用,可與鹽析法結合用。


        (3)低溫有機溶劑沉淀法

        用與水可混溶的有機溶劑,甲醇,乙醇或丙酮,可使多數蛋白質溶解度降低并析出,此法分辨力比鹽析高,但蛋白質較易變性,應在低溫下進行。



        根據蛋白質分子大小的差別的分離方法

        (1)透析與超濾

        透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。

        超濾法是利用高壓力或離心力,強使水和其他小的溶質分子通過半透膜,而蛋白質留在膜上,可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。


        (2)凝膠過濾法

        也稱分子排阻層析或分子篩層析,這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠(Sephadex ged)和瓊脂糖凝膠(Purose  6 Fast Flow  )。

        蛋白質在不同pH環境中帶電性質和電荷數量不同,可將其分開。


        (1)電泳法

        各種蛋白質在同一pH條件下,因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳,這是利用一種兩性電解質作為載體,電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度,當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時,到達各自等電點的pH位置就停止,此法可用于分析和制備各種蛋白質。


        (2)離子交換層析法

        離子交換劑有陽離子交換劑(如:SP Purose? 6 Fast Flow)和陰離子交換劑(Q Purose? 6 Fast Flow),當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時,帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上,隨后用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。



        根據配體特異性的分離方法-親和層析法

        親和層析法(aflinity chromatography)是分離蛋白質的一種極為有效的方法,它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來,而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand)的分子能特異而非共價地結合。



        蛋白提取純化注意事項


        在進行任何一種蛋白質純化的時候,都要時刻注意維護它的穩定性,保護它的活性,有一些通用的注意事項需要牢記,它們包括:


        1、操作盡可能置于冰上或者在冷庫內進行。

        2、不要太稀,蛋白濃度維持在μg/mL~mg/mL。

        3、合適的pH,除非是進行聚焦層析,所使用的緩沖溶液pH避免與pI相同,防止蛋白質的沉淀。

        4、使用蛋白酶抑制劑,防止蛋白酶對目標蛋白的降解;在純化細胞中的蛋白質時,加入DNA酶,降解DNA,防止DNA對蛋白的污染。

        5、避免樣品反復凍融和劇烈攪動,以防蛋白質的變性。

        6、緩沖溶液成分盡量模擬細胞內環境。

        7、在緩沖溶液中加入0.1~1mmol/LDTT(二硫蘇糖醇)(或β-巰基乙醇),防止蛋白質的氧化。

        8、加1~10mmol/LEDTA金屬螯合劑,防止重金屬對目標蛋白的破壞。

        9、使用滅菌溶液,防止微生物生長。



        提取純化常見問題


        1、蛋白純化標簽應該如何選擇?

        答:在進行蛋白表達時,選擇合適的標簽有利于蛋白的純化,促進蛋白的可溶性,因此了解幾種常用的蛋白純化標簽很重要。


        一般來說,常用的蛋白純化標簽主要有His tag、GST tag、MBP tag、NusA tag、Strep tag,那么這些蛋白純化標簽有什么不同之處呢?


        His tag(組氨酸標簽)融合蛋白是目前最常見的表達方式,其優點是標簽小,純化步驟簡便,純化條件溫和,能純化可溶性/包涵體蛋白,一般不會影響蛋白的功能結構,且可以產出大量的目標蛋白,但該標簽不適合易氧化蛋白或膜蛋白的純化。

        GST tag(谷胱甘肽巰基轉移酶)的洗脫條件溫和,有助于保持蛋白功能活性,適合pull-down 檢測,具有很好的線性動態范圍,但分子量較大,可能會影響蛋白質的功能和下游實驗,如果蛋白不可溶,很難用變性的方法進行純化。

        MBP tag(麥芽糖結合蛋白標簽)可以減少目標蛋白的降解,增加蛋白的表達量和穩定性,提高表達產物的水溶性,但標簽較大,對蛋白的結構和功能會有一定影響。


        NusA tag(轉錄終止/抗終止蛋白標簽)不具有獨立的純化標簽功能,需要和其他標簽(如His標簽)聯用,可提高蛋白質的溶解性,但由于分子量較大,對蛋白下游應用會有影響。


        Strep tag(strep標簽)能產出高純度(95%)的目標蛋白,且能保持目標蛋白活性,主要是因其純化流程溫和。其次,能進行變性條件下的純化。在用于WB/ELISA,可偵測目標蛋白。另外,還可固定目標蛋白,檢測蛋白質交互作用,或更進一步用以篩選治療用蛋白質,或是工業用酵素。但Strep tag純化系統的價格相對His tag而言較高,所產出的目標蛋白數相對較少。



        2.利用疏水性質,用反向 HPLC 方法分離的原理?

        答:反相和疏水都是依據物質的極性來純化的,極性越強先出來,極性越弱越后出,洗脫疏水是高鹽吸附低鹽洗脫,反像是極性強的流動相吸附,降低它的極性洗脫,選擇主要是依據填料的特點以及樣品本身的特點而改變的。


        疏水的填料疏水集團密度只是反相的 10%左右,其他的都是親水的,而反相正好相反,它的表面全是疏水基團,因此疏水一般需要高鹽吸附,低鹽洗脫,反相一般用甲醇水乙睛水吸附,洗脫是逐漸增加有機溶劑的量.由于以上的原因,疏水比反相要溫和,蛋白一般不變性,由于填料多為瓊脂糖凝膠,所以蛋白回收率高,而反相適合做分析多,也有做制備的,那也是一些分子量相對小的多肽,反相的回收率也低, 因為硅膠雜吸附的原因.疏水色譜是純化蛋白的另一個有力的工具.


        3.重組蛋白A瓊脂糖凝膠 FF 能一次純化大量血清 IgG 嗎?如幾十毫升,如用環氧活化的瓊脂糖凝膠純化血清 IgG,先要偶聯其相應配基如抗體或蛋白 A 是嗎?這里瓊脂糖凝膠用環氧活化的意義是什么?

        答:幾十毫升如果一次純化也就用幾十毫升的 重組蛋白 A 瓊脂糖凝膠 FF 就可以,也可以分兩三次純化,這都沒有問題,如果是你想做血清中的抗體純化也可以把抗原偶聯到環氧活化瓊脂糖凝膠上, 這樣得到的抗體更純, 一般不選擇蛋白 A, 環氧活化便宜,而且相成的鍵很穩定,沒有非特異吸附,是個不錯的方法.

        4. 通過 His 標簽純化的蛋白,雜帶比較多,如何改進?

        答:(1)如果純化的是上清,蛋白酶會部分降解目的蛋白,可通過加多種蛋白酶抑制劑改進。

        (2)可提高雜蛋白與鎳柱結合起始咪唑濃度,以降低雜蛋白與鎳柱的親和力。

        (3)雜蛋白和目的蛋白結合,可通過超聲前加入去垢劑的方式消除(1%-2%Tritonx-100)。


        5. 鎳柱使用中出現棕色是怎么回事?

        答:出現這樣的情況,主要是緩沖液中 DTT 的影響,DTT 會對鎳柱的顏色和純化效率有很大的影響,在堿性的緩沖液條件下鎳離子會被 DTT 還原生成棕色的沉淀,所以所有鎳柱的生產商都強調要盡量避免 DTT 的參與(一般的鎳柱耐受小于 5mM DTT,推薦緩沖液中不要超 2mM DTT)

        6. 鎳柱堵了怎么辦?

        答:(1)柱子發生堵塞,可能是樣品中細胞碎片或其他雜顆粒所致,所以樣品一定要高速離心,并過0.22或者0.45的膜

        (2)上清純化時,蛋白發生變性,有絮狀物產生,趕緊加入 1-2mM DTT (上清樣品處理要在冰浴中進行),還不行加尿素變性,使其在變形環境下。

        (3)樣品處理時的料液比不要太小,否則黏度大,或者導致蛋白析出或變性,料液比要在 1/10-1/15 之間較適宜。


        7. 純化過程中,蛋白出現了渾濁,怎么辦?

        (1)出現渾濁,說明蛋白處在不穩定的環境中或者自身就不穩定,所以要檢查緩沖體系是否正確,環境是否低溫,或在緩沖液中加入還原劑 DTT。

        (2)加入肌氨酸鈉,迅速使蛋白變性,消除渾濁現象。


        8. 沒能純化到帶 His 標簽的蛋白,蛋白都流穿了(未掛柱)?

        (1)超聲的功率不對(太大,蛋白炭化,太小,蛋白沒有釋放) 

         策略:改變超聲功率,并在超聲前加入溶菌酶。

        (2)樣品或者是結合緩沖液不正確 ;

        策略:檢測 pH 及樣品和結合緩沖液的組成份。

        (3)組氨酸的標簽沒有完全的暴露 ;

        策略:在變性條件下(用 8M 脲,6M 鹽酸胍,1%SDS) 并加入 1-2mMDTT 進行純化。

        (4)His 標簽丟失;

        策略 1:WB 或者 anti-his 的抗體檢查 His 是否表達,上游構建,改變 his-tag 的位(C-terminal orN-terminal),必要時增加 his 個數(常用 6-10 個);

        策略 2:孵育的時間不夠,降低流速和增加孵育的時間;

        策略 3:改變螯合的金屬離子,尋找到最佳的結合金屬離子。

        Ni2+通常是從宿主細胞蛋白中純化大多數(組氨酸)6 標記的重組蛋白質的首選金屬離子,也是一般最常用的離子。

        蛋白和金屬離子之間的結合強度受幾種因素影響,包括長度、位置、親和標記在蛋白的暴露程度、所用離子的類型、以及緩沖液的 pH,因此一些蛋白用其他離子可能更容易地進行純化而不用 Ni2+。可以利用 Hitrap IMACHP 來篩選不同的金屬離子。


        9. 蛋白掛在柱子上洗脫不下來,怎么解決?

        答:(1)洗脫條件太溫和(組氨酸標記的蛋白質仍然結合在柱上,結合力較強) 策略:用增加咪唑的梯度洗脫或降低pH 來找出最佳的洗脫條件。

        (2)降低 PH 的方法洗脫的,因為若 PH 低于 3.5,會導致鎳離子脫落策略:改變洗脫辦法,咪唑競爭性洗脫。

        (3)蛋白已沉淀在柱上策略:減少上樣量和孵育的時間,試用去污劑(1%-2%Tritonx-100)或改變 NaCl 的濃度,或在變性條件下洗脫(用 8M 脲,或 6M 鹽酸胍),最終也可在洗脫 Buffer 中加入 2mMDTT 或者 0.5%肌氨酸鈉進行洗脫。

        (4)非特異性疏水或其他相互反應策略:加非離子去污劑到洗脫緩沖液(如,2%Triton X-100)或增加 NaCl 的濃度。


        10. 如何處理樣品,可使其初步提純(如何洗去蛋白的自身帶)?

        答:(1)上清樣品處理,要加入去污劑,蛋白酶抑制劑,還原劑,還要注意溫度及超聲破碎的參數。

        (2)去大腸桿菌自身帶(兩條 30KD-40KD)可用非變性緩沖液超聲懸?。尤肴ス竸?,離心 6000r/min,30min,10℃。(若效果不夠可繼續上述步驟)。

        (3)大腸桿菌包涵體的洗滌,可用包涵體洗液多洗幾遍,也可用 1M/2M/4M/8M 尿素逐步溶解,可選取其中純度最佳的。

        (4)可用硫酸銨沉淀法,初步提純。


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